医用纳米材料检测与评价标准

肾细胞凋亡检测

发布时间:2018-01-29 | 【打印】 【关闭】

                                                                          引  言

  本文描述了一种监测经纳米粒子处理的猪近端肾小管细胞(porcine renal proximal tubule cells, LLC-PK1)凋亡的实验方法。本方法利用荧光方法确定半胱天冬酶3caspase-3)的活化程度。

                                                                     肾细胞凋亡检测

                                       Apoptsis assay for kidney cells

1.原理

  Caspase-3荧光蛋白酶检测基于以下原理。哺乳动物细胞的凋亡始于半胱氨酸蛋白酶中caspase家族的活化。本实验通过检测caspase-3的底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin, AMC)酶解后游离AMC所产生的荧光(λex=380nm, λem=460nm),对caspase-3的活化进行体外定量分析。游离AMC可以通过酶标仪定量检测[1-3]。

2.仪器与试剂

  以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的,可以由同类产的其他供货商所替代。

  2.1 试剂

  

  2.2 耗材

  96孔板平底细胞培养板、离心管(15mL)、6孔平底细胞培养板、96孔荧光检测板(全黑)

  2.3 仪器

  离心机(带有96孔板适配器)、冰箱(4℃和-20℃)、细胞培养箱(37℃,5% CO2,95%湿度)、生物安全柜(可处理生物相关材料)、倒置光学显微镜、血细胞计数器(细胞计数仪)、涡旋混匀仪、酶标仪、平板振荡器

  2.4 细胞系

3.试剂配制

  3.1 M199完全培养基(无菌):5%FBS(经过热灭活)、2mM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1.5g/L to 2.2g/L NaHCO3。避光保存在2-8℃,不超过一个月。使用前,要37℃水浴中预热。

  3.2 5μM顺铂,阳性对照(positive control,PC):在DMSO中配制50mM顺铂储存液。将50mM储存液用M199完全培养基稀释至5μM。0.2μm过滤除菌。

  3.3 阴性对照(negative control,NC):M199完全培养基。

  3.4 提前配制的溶液(参见Caspase-3荧光检测试剂盒,-20℃保存):

  3.4.1 根据实验用量,将1x检测缓冲液(assay buffer)用水(试剂盒提供)稀释至1x检测缓冲液。

  3.4.2 将2.5mg caspase-3底物(Ac-DEVD-AMC)溶于370μL DMSO,终浓度为10mM,分装后-20℃保存。

  3.4.3 将0.5mg caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-AMC)溶于500μL DMSO,终浓度为2mM,分装后-20℃保存。工作液为1x检测缓冲液稀释至200μM。

  3.4.4 将5μg caspase-3阳性对照溶于50μL水中(试剂盒提供),终浓度为1000μg/mL,分装后-70℃保存.使用前,用1x检测缓冲液稀释至200μM。

  3.4.5 反应液配制:每孔加200μL反应液,根据需要配制相应体积。如将5μL 10mM的底物Ac-DEVD-AMC加入到3mL 1x检测缓冲液中,避光保存。

  3.4.6 AMC标液配制:1mg AMC标物溶于0.57mL DMSO中,终浓度约为10mM。精确浓度需用紫外吸收法测量。用1x检测缓冲液将AMC溶液稀释200倍,放入石英比色杯中,测量354nm处的吸光度(A354)。根据朗勃特-比尔定律公示A354=εbc,其中ε为354nm处的摩尔消光系数16,b为比色杯的厚度(cm),c为蛋白浓度(mol/L,M)。

  3.4.7 将5x裂解液用水(试剂盒提供)稀释为1x裂解液,4℃保存。

  3.5 热灭活FBS:在2-8℃解冻一瓶FBS,热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min,并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量(~50mL),分装后保存在-20℃。每次使用前,在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。

4.样品制备:纳米粒子样品溶液的配制

  根据LLC-PK1肾细胞毒性实验(NCNST-IVT-131)确定待测样品的浓度。将纳米粒子完全溶解在M199完全细胞培养基中,浓度为检测浓度的2倍(2x)。如果被检测的纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL,那么需要检测的浓度按照1:5的稀释比例,依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008mg/mL。每一个浓度的纳米粒子应该准备至少4个平行测定(n=4)。

5.实验步骤[4,5]

  5.1 培养细胞2天后,细胞密度达到80-90%。收集细胞,用台盼蓝进行细胞计数。如果活细胞比例达到90%以上,可以继续后面的实验。

  5.2 将细胞重悬至M199完全培养基中,终浓度为2.5×105cell/mL。

  5.3 在96孔细胞培养板中,每孔加入200μL上述细胞悬液(5×104个细胞/孔)。PC和NC需准备3个平行测定,待测样品4个平行测定(见图1)。

  5.4 在37℃,5% CO2,95%湿度的培养箱中孵育培养板24h(细胞密度应达到80%)。

  5.5 按照图1所示,将细胞培养基分别换成200μL M199完全培养基(NC)、含纳米粒子溶液(步骤4中配制)和PC溶液。设置时间点为6h、24h和48h。

  

                                                                   图1 细胞培养加样示例

  5.6 Caspase-3活性检测

  5.6.1 将孔中培养基吸出,用100μL室温1xPBS洗细胞,将96孔板置于冰上。

  5.6.2 每孔加30μL冷的1x裂解液,在冰上放置15-20min。将细胞裂解液收集在EP管中。

  5.6.3 离心,2000xg(或10000rpm),4℃,10min。

  5.6.4 转移10μL上清至96孔荧光检测板中,并在每个样品孔中加入200μL反应液。其余上清(~20μL)用于蛋白测定。并安排两个空白反应液平行孔(200μL反应液)和两个caspase-3对照平行孔(10μL caspase-3+200μL反应液)。(图2)

  5.6.5 37℃孵育1-1.5h。

  5.6.6 在酶标仪上读取激发波长为380nm、发射波长为460nm的荧光强度(狭缝宽度为5nm)。

  

                                                                  图2 荧光检测加样示例

  5.7 蛋白测定(Bradford检测)

  5.7.1 使用前,现将1x Quick Start Bradford蛋白染色液恢复至室温,反复倒转使里面液体充分混匀。

  5.7.2 用0.05M NaOH稀释2mg/mL的BSA储存液,按照表1配制一系列BSA标液,绘制浓度范围为125-1500μg/mL标准曲线。每个标液准备3个平行测定。

                                                             表1 BSA系列标液的配制方法

  

  5.7.3 根据图3,在96孔细胞培养板中加入5μL标液(5.7.2中制备的)、细胞裂解物(5.6.4中制备的)或空白(水)。准备三个平行测绘制浓度范围为125-1500μg/mL标准曲线。每个标液准备3个平行测定。

  5.7.4 每孔加入250μL 1x蛋白染色液。

  

                                                               图3 蛋白测定加样示例

  5.7.5 室温孵育至少5min,不长于1h。

  5.7.6 用酶标仪检测595nm处的吸光度OD。

6.数据分析

  6.1 对BSA标准曲线进行线性回归分析(y=x(斜率)+y(截距)),并根据样品吸光度计算样品的蛋白浓度。根据下面的方程计算蛋白浓度(根据5.6.4,样品体积约为20μL):

  

  6.2 变化系数百分比:CV%=SD/平均值×100,其中SD为标准偏差。

  6.3 总蛋白标归一化后的Caspase活性:

  

  样品荧光和NC的荧光均为扣除空白背景值后的荧光强度。

  每个阳性对照和样品均需计算均值、SD和CV%。

7.接受标准

  7.1 24h PC的caspase活性至少为NC的10倍。

  7.2 PC、NC和样品平行测定的CV%应在50%以内。

  7.3 达到7.1和7.2标准的检测结果可以被接受。否则,应重复实验直到达到接受标准。

  7.4 对实验数据进行统计分析,如果总蛋白归一化的NC和样品荧光值之间具有显著性差异,则认为荧光变化是显著的,说明样品的处理显著地影响了细胞凋亡。

8.缩略语

  AMC:7-氨基-4-甲基香豆素

  BSA:牛血清白蛋白

  CV:变化系数

  DEVD:天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸

  DMSO:二甲亚砜

  DTT:二硫苏糖醇

  FBS:胎牛血清

  h:小时

  LLC-PK1:猪肾细胞

  λex:激发波长

  λem:发射波长

  min:分钟

  NaOH:氢氧化钠

  PBS:磷酸盐缓冲液

  SD:标准偏差

9.参考文献

[1] ISO 10993-5 Biological evaluation of medical devices: Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity.

[2] F1903-98 Standard Practice for Testing for Biological Responses to Particle in vitro.

[3] Wang et al. Cell Bio. Int.(2005) 29: 489-496.

[4] The datasheet of Caspase-3 Fluorometeric Assay kit from Sigma(#CASP3F).

[5] Stem ST, Potter TM. LLC-PK1 kidney cell apoptosis assay. NCL Method(2010) GTA-5(Version 1.1):1-11.

  

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