医用纳米材料检测与评价标准

肾细胞毒性检测

发布时间:2018-01-05 | 【打印】 【关闭】

                                                              引  言

  本实验方案描述纳米粒子对于猪的近端肾小管细胞(LLC-PK1)的细胞毒性检测。本文采用的是乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放法[1, 2]。

 

                                                                   肾细胞毒性检测

                                           Cytotoxicity assay for kidney cells

1.原理

  本法利用Roche 公司的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)细胞毒性检测试剂盒[3]LDH是一种细胞裂解时释放到细胞质的胞质酶。因此,LDH法可以检测膜的完整性。LDH法测定的原理:(1)乳酸脱氢酶氧化乳酸盐为丙酮酸盐;(2)丙酮酸盐与四氮唑盐(2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride, INT)反应形成的甲臜;(3)用分光光度法检测水溶的性甲臜染料[4-6]。也可根据样品来源不同,按照参考文献[7]检测。

2.仪器与试剂

  以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的,可以有同类产品的其他供货商所替代。

  2.1 试剂

  

  2.2 耗材

  移液管(2mL5mL10mL)、24孔和96孔平底细胞培养板、离心管(1.5mL, 5mL15mL)

  2.3 仪器
  离心机(带有96-孔板适配器)、冰箱(4℃和-20℃)、细胞培养箱(37℃,5%CO2,95%湿度)、生物安全柜(可处理生物相关材料)、倒置荧光显微镜、血细胞计数器(细胞计数仪)、涡轮混匀仪、酶标仪、平板振荡器。
  2.4 细胞系
  LLC-PK1(猪的近端肾小管细胞系)
3.试剂配制
  3.1 M199完全培养基(无菌):5%FBS(经过热灭活)、2nM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1.5g/L到2.2g/L NaHCO3。避光保存在2-8℃,不超过一个月。使用前,要37℃水浴中预热。
  3.2 检测培养基(Assay medium,AM):1% FBS(经过热灭活)、2mM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、M199培养基。避光保存在2-8℃,不超过一个月。使用前,要37℃水浴中预热。
  3.3 热灭活FBS:在2-8℃解冻一瓶FBS,热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min,并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量(~50mL),分装后保存在-20℃。每次使用前,在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。
  3.4 1% Triton-X-100溶液(最大稀释对照):用一定体积的AM稀释Triton-X-100,终浓度为1%。然后0.2μm过滤除菌。
  3.5 25mM APAP溶液(阳性对照):将19mg的APAP溶于5mL AM中,终浓度为25mM。然后0.2μm过滤除菌。
  3.6 LDH相关溶液的配制:(1)将1瓶催化剂溶于1mL蒸馏水中,10min,涡旋混匀(在4℃可保存几周)。(2)反应液:根据检测样品的数量,100μL/孔,将上述催化剂溶液和染料按照1:45的比例配置,建议现配现用。(在4℃可保存几周)。(3)LDH标液:将一定量的LDH标液溶于AM中,终浓度为0.05U/mL。
4.样品制备:纳米粒子样品溶液的配制
  4.1 将待测样品完全溶解在AM中,浓度为1x终浓度。如果被检测的银纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL,那么需要检测浓度按照1:5的稀释比例,依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008mg/mL。每一个浓度的纳米粒子应该被分析3次,每次两个重复(n=6)。
  4.2 选择合适的纳米粒子溶液的浓度时,必须考虑以下几个问题:纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度、生理条件下的pH值(6-8)、纳米粒子的可用性及稳定性。如果1mg/mL的最高工作浓度不适合,需要对此浓度进行调整,一定要在适合的浓度下分析样品。
  4.3 预实验(确认纳米粒子对于LDH活性是否产生影响)
  4.3.1 样品组选择3个浓度(低、中、高)进行预实验,对照组为AM。每个样品组或对照组设置3个平行孔。
  4.3.2 在所有的孔中加入100μL M199完全培养基。按表1,在相应的孔中加入50μL LDH标液(0.05U/mL)、50μL不同浓度的样品溶液(4x终浓度)或AM,使得每孔的总体积为200μL。
  4.3.3 混合后直接用于检测,或培养不同的时间(24h、48h)后再检测。检测前,将100μL上清液转移至另一块96孔板中,每个孔加入100μL反应液混合,震荡混匀后,室温避光反应30min。
  4.3.4 在酶标仪中测试4.3.3混合溶液在490nm和680nm处的吸光度。
  4.3.5 比较B-A与D-C两个差值,根据T-test结果,判断样品是否会干扰LDH检测,在后续正式实验中,避免使用有影响的样品浓度。
      表1 预实验每个实验组的加样设计方案
  
5.实验步骤
  5.1 培养细胞2天后,细胞密度达到80-90%。收集细胞,用台盼蓝进行细胞计数。如果活细胞比例达到90%以上,可以继续后面的实验。
  5.2 将细胞重悬至M199完全培养基中,终浓度为2×105cell/mL(LLC-PK1)。
  5.3 按处理时间不同准备2个24孔板(分别为24和48小时),按照图1每孔加入500μL细胞悬液,每个样品或对照徐对应两个重复孔。(每组设1个无细胞对照孔,此时为空)
  
 图1 24孔板加样图。样品1-4为不同浓度的样品溶液。APAP的终浓度为25mM。Triton-X-100的终浓度为1%
  5.4 培养板在细胞培养箱中,37℃,5%CO2,培养24小时。
  5.5 去掉上清,然后按照图1,样品组每孔再加入400μL纳米粒子溶液(4.1中配制)。阳性对照组每孔加入400μL APAP溶液(3.5中配制)。阴性对照组每孔加入400μL AM。最大释放组每孔加入400μL 1%Triton(3.4中配制)分别在细胞培养箱中(37℃,5%CO2)孵育24或48小时。
  5.6 将每孔中的上清液全部(360μL)转移至1.5mL EP管中,室温离心20min,转速大于16000xg。
  5.7 将上清转移至96孔板中,每管上清分别对应三个平行孔,每孔加100μL。(图2)
  5.8 每孔加入100μL反应液(见3.6.2)。震荡混匀后,室温避光反应30min。
  5.9 在酶标仪上读取490nm和680nm(参考波长)处的吸光度,两个吸光度的差值为该孔的测量值(OD)。
  
   图2 96孔板加样图例。样品1-4为不同浓度的样品溶液。APAP的终浓度为25mM。Triton-X-100的终浓度为1%
6.数据分析
  6.1 变化系数百分比:CV%=SD/mean×100,其中SD为标准偏差,mean为平均值。
  6.2 LDH释放百分比 LDH%=(样品释放OD-自然释放均值OD)/(最大释放均值OD-自然释放均值)×100%
  OD=含有细胞的测量值-相应无细胞对照测量值均值
  自然释放:细胞+400μL AM
  自然释放对照:400μL AM
  最大释放:细胞+400μL 1% Triton-X-100
  最大释放对照:400μL 1% Triton-X-100
  样品释放:细胞+400μL待测样品或阳性对照(APAP)
  样品释放对照:400μL待测样品或阳性对照(APAP)
7.接受标准
  7.1 对于APAP阳性对照组,48小时的细胞活力应小于75%,释放的总LDH%应大于15%。
  7.2 阳性对照以及样品的CV%应小于50%。
  7.3 需同时满足7.1和7.2的标准,检测可认为成功。否则,需重新进行检测。
8.缩略语
  APAP:对乙酰氨基酚
  CV:变更系数
  FBS:胎牛血清
  LDH:乳酸脱氢酶
  min:分钟
  PBS:磷酸缓冲盐溶液
9.参考文献
[1]ISO 10993-5 Biological evaluation of medical devices: Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity.
[2]F1903-98 Standard Practice for Testing for Biological Responses to Particles in vitro.
[3]Cytotoxic detectionkit(LDH)instruction(#11644793001),Roche Ltd.
[4]Decker T, Lohmann-Matthes ML. J. Immunol Methids(1988)15:61-69.
[5]Korzeniewski C, Callewaert DM. J. Immunol Methods(1983)64:313-320.
[6]Stem ST, Potter TM. LLC-PK1 kidney cytotoxicity assay. NCL Method(2010)GTA-1(Version 1.1):1-11.
[7]YY/T 0993-2015,医疗器械生物学评价 纳米材料:体外细胞毒性实验(MTT试验和LDH试验)。
 
 
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