医用纳米材料检测与评价标准

凝血检测

发布时间:2017-12-27 | 【打印】 【关闭】

                                                            引  言

  本文描述了一种评估纳米粒子制剂影响血浆凝固时间的实验方法。凝血,即血液凝固,是一个很复杂的过程。主要有三种途径:内源性(也称接触激活途径,因为它是由受损的表面激活的)、外源性(也称组织因子途径)和共同途径。每一途径都可通过特殊的检测进行评价。例如,激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)检测可以评价内源性途径,凝血酶原时间(prothrombin timePT)检测可评价外源性途径,而凝血酶时间(thrombin timeTT)可以指示共同途径的功能性。每一途径都包括许多凝血因子,其中一些在不同的途径中都发挥作用。APTT检测测量的是因子XIIXIIXVIIIXVIIPT检测测量的是因子VIIXVII。三种方法都可以检测纤维蛋白原。商业化发体外检测中,PT检测主要用于筛查凝血因子VII的缺乏,APTT用于检测凝血因子XII的不足,TT检测用于评价纤维蛋白原的消耗[1]。

                                                                       凝血检测

                                              Coagulation assay

1.原理

  本检测将通过三个独立实验分析血浆凝固:凝血酶原时间(PT)、激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)。将纳米粒子和新鲜人血浆(乏血小板)共同孵育,使用血凝度计检测凝血时间,与各检测项目的标准对照进行比较。当正常血浆在体外接触纳米粒子后,预期将缺失某种凝血因子而导致血浆凝固延迟。凝血检测也可按照国家标准[2-3]进行。

2.仪器与试剂

  以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的,可以由同类产品的其他供货商所替代。

  2.1 试剂

  

  2.2 耗材  

  1.5mL EP管、量程包括0.0510mL的移液器

  2.3 仪器

  离心机、冰箱,2-8ACL-TOP全自动凝血分析仪(Instrumentation Laboratory.Co,美国)

3.试剂配制

  3.1 检测血浆:使用1h内收集的新鲜全血,2500xg20-22,离心10min,收集血浆并混合。混合好的血浆在室温可稳定存放8h,不能冷藏或冷冻。

  3.2 纳米粒子处理的检测血浆:在1.5mL离心管中混合50μL纳米粒子(步骤5中制备)和500μL检测血浆(步骤4.1),混匀后在37孵育30min。每种待测样品制备3份平行样。

  3.3 阴性对照:在1.5mL离心管中混合50μL 1xPBS和500μL检测血浆(步骤4.1),制备2份平行样。混匀后在37孵育30min。

  3.4 体系对照:500μL检测血浆(步骤3.1),制备2份平行样,与上述样品一起在37孵育30min。

4.样品制备:纳米粒子溶液的配制

  本实验需要160μL 10倍最高检测浓度的纳米粒子,溶解或重悬于1xPBS或其他适当介质中。选择合适的银纳米粒子溶液的浓度时,必须考虑以下几个问题:银纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度;生理条件下的pH值;纳米材料的可用性及稳定性。纳米粒子常规需要检测四个浓度:1.00.20.040.008mg/mL。但是,当体内PK实验已知纳米粒子在血浆中的浓度时,最高体外检测浓度可以选择该浓度的10倍、30倍或100倍。其他三个检测浓度可以由最高浓度连续1:5稀释获得。在最初的筛查中,推荐使用可能的最高浓度。当纳米粒子携带药物时,浓度选择需根据活性药物成分(API)而不是整个合成物来确定。如果最高检测浓度是1.0mg/mL,纳米粒子储液的浓度应为10mg/mL(在检测过程中,样品会被稀释10倍,见步骤4.2)。每个检测浓度(1.00.20.040.008mg/mL)均需进行350μL的平行测定(n=3)。

5.实验步骤

  5.1 参考仪器快捷设置列表及试剂体积,设置四种检测的仪器参数。仪器使用前需预热5-10min。

  5.2 将孵育好的样品转入比色皿中。

  5.3 在凝血分析仪指定位置加入相应PT、TT及APTT检测试剂,然后在检测行中依次放入比色皿。

  5.4 机器开始检测,并给出相应的数值。

6.计算

  根据下式计算每个对照和检测样品的变化系数百分比:

  

7.接受标准

  每个对照和检测样品的CV%应不超过5%。

8.缩略语

  API:活性药物成分

  APPT:激活部分促凝血酶原激酶时间

  CV:变化系数

  h:小时

  min:分钟

  N:正常

  PK:药物代谢动力学

  PT:凝血酶原时间

  SD:标准偏差

  TT:凝血酶时间

9.参考文献

[1]Dobrovolskaia MA, Neun BW. Coagulation Assays. NCL Method (2011) ITA-12 (Version 1.1):1-8.

[2]GB/T16886.4-2003/ISO 10993-4:2002,医疗器械生物学评价 第4部分 与血液相互作用试验选择.

[3]GB/T14233.2-2005,医用输液、输血、注射器具检验方法 2部分:生物学试验方法。

   

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